siRNA
siRNA 是分子中的一種短 (21-23 bp) 雙鏈 RNA 核苷酸，在細胞中發(fā)揮各種生物系統(tǒng)的功能。
siRNA轉(zhuǎn)染是利用小干擾RNA（siRNA）來靶向并沉默特定基因的一種技術(shù)，廣泛應用于基因功能研究和疾病防治等領(lǐng)域。這項技術(shù)涉及將siRNA導入細胞中，從而通過RNA干擾（RNAi）機制降低靶基因的表達。
為了成功優(yōu)化 siRNA 轉(zhuǎn)染，需要合適的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染方法來進行體外和體內(nèi)RNAi 實驗。這些過程因細胞類型和轉(zhuǎn)染方法而異。
siRNA轉(zhuǎn)染原理
siRNA它通過與細胞內(nèi)特定mRNA序列的互補配對，觸發(fā)RNA干擾機制，從而抑制對應基因的翻譯。這一過程主要涉及以下幾個步驟：
1、siRNA通過不同的轉(zhuǎn)染方法（如磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等）進入細胞
2、細胞內(nèi)的Dicer酶將雙鏈RNA切割成小片段，并與RNA誘導沉默復合體（RISC）結(jié)合
3、反義鏈與靶mRNA配對，導致mRNA降解，從而阻止其翻譯成蛋白質(zhì)
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siRNA無效經(jīng)驗總結(jié)
1、你的siRNA真的轉(zhuǎn)入細胞了嗎？
轉(zhuǎn)染效率有多少？
| 一、siRNA發(fā)揮作用的前提是要成功進入到細胞質(zhì)中。 |
| 二、用熒光標記比如Cy3 siRNA作為熒光對照，預實驗確認熒光效率及對應的siRNA轉(zhuǎn)染最佳濃度。要注意的是，cy3熒光在細胞外呈“亮點狀”，進入細胞質(zhì)中熒光形態(tài)與細胞形態(tài)基本一致，大部分能觀察到“質(zhì)亮核暗”的現(xiàn)象。 |
| 三、熒光（轉(zhuǎn)染）效率應高于90%才能有效抑制目的基因的mRNA表達。如果少量siRNA進入細胞，作用于基因后，有時候細胞會有補償機制，表達量反而升高。 |
| 四、也可以借助陽性對照siRNA判斷轉(zhuǎn)染效率。如果陽性對照基因干擾效率能達到70%以上，說明轉(zhuǎn)染成功且轉(zhuǎn)染效率較高。 |
2、siRNA可以轉(zhuǎn)染進細胞
但干擾效果不理想？
| 一、檢測時間點：建議轉(zhuǎn)染后48小時檢測RNA水平變化，48-72小時檢測蛋白水平變化。不同基因的半衰期是不同的，siRNA干擾是拋物線形的，多做幾個時間點有利于siRNA干擾效果的測定。過于密集的細胞將影響細胞狀態(tài)，從而影響實驗結(jié)果。 |
| 二、推薦qRT-PCR引物設(shè)計在target位置的兩側(cè)，而不是同側(cè)。目前已經(jīng)知道的siRNA介導的基因knockdown機制是RSIC先介導靶mRNA的切割，切割導致靶mRNA的降解，由于切割和降解可能具有不同的時間點，因此，設(shè)計于同側(cè)的PCR引物可能導致假陰性結(jié)果或knockdown效率的低估。 |
| 三、基因表達：目的基因在細胞中無本底或者幾乎不表達（比如Ct值>30），如果這樣，建議換一種細胞看看。 |
| 四、干擾靶點不合適，需重新設(shè)計siRNA，可參考文獻序列。 |
| 五、此外，還應排查qRT-PCR的擴增效率，熔解曲線是否異常，內(nèi)參Ct值是否處于13~18之間，三重復數(shù)據(jù)差異，組間內(nèi)參表達差異。 |
3.轉(zhuǎn)染效率低的原因？
| 一、轉(zhuǎn)染體系：siRNA用量（終濃度建議在30-120nM），轉(zhuǎn)染試劑和siRNA使用比例，有無血清要求，無抗生素轉(zhuǎn)染等。 |
| 二、轉(zhuǎn)染試劑：根據(jù)實驗要求和細胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。 |
| 三、細胞原因：轉(zhuǎn)染效率跟細胞狀態(tài)、細胞代數(shù)、細胞密度等有關(guān)，一般低的細胞代數(shù)（<50）能確?；蛐筒蛔儭Ｗ钸m合轉(zhuǎn)染的細胞是經(jīng)過幾次傳代后達到指數(shù)生長期的細胞，細胞生長旺盛，最容易轉(zhuǎn)染。有的細胞出了名難轉(zhuǎn)染，比如懸浮、干細胞、原代細胞等，可以嘗試慢病毒、電轉(zhuǎn)等。 |
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低毒性：轉(zhuǎn)染細胞形態(tài)良好并表達大量的轉(zhuǎn)染基因蛋白
操作簡便：可以直接將脂質(zhì)體復合物加入到含血清的培養(yǎng)基中
多樣性：適合瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染試驗
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