研究背景
腎細(xì)胞癌(RCC) 是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率呈上升趨勢。透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(ccRCC)是RCC最主要的病理亞型，其特點(diǎn)是遷移能力強(qiáng)，對放療和化療具有耐藥性。大多數(shù)晚期RCC患者會在6-15個月內(nèi)對舒尼替尼等靶向藥物產(chǎn)生耐藥性。因此，探索RCC進(jìn)展的機(jī)制、推斷有效的生物標(biāo)記物以用于 RCC的早期檢測和預(yù)后預(yù)測迫在眉睫。
文獻(xiàn)來源
華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院章小平教授團(tuán)隊(duì)在期刊《Clinical and Translational Medicine》上發(fā)表題為“circRARS synergises with IGF2BP3 to regulate RNA methylation recognition to promote tumour progression in renal cell carcinoma”的研究論文，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)源自精氨酰-tRNA合成酶1(RARS1)2-4號外顯子的circRNA hsa_circ_0001550(circRARS)與IGF2BP3的KH1-KH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合。IGF2BP3/circRARS通過m6A依賴性方式介導(dǎo)了CAPN15,CD44,HMGA2,TNRC6A和ZMIZ2的mRNA穩(wěn)定性。闡明了IGF2BP3/circRARS復(fù)合物在RCC進(jìn)展中的致癌功能，并為RCC患者提供了一個新的治療靶點(diǎn)。
研究結(jié)果
研究人員對七項(xiàng)研究進(jìn)行了薈萃分析，證實(shí)IGF2BP3是影響RCC患者預(yù)后的危險因素(圖1A)。接著，在多個公共數(shù)據(jù)庫中測定了TCGA-KIRC隊(duì)列中IGF2BP3的表達(dá)，結(jié)果表明IGF2BP3 mRNA在RCC組織中的表達(dá)顯著增高，并與預(yù)后相關(guān)(圖1C,D)。再使用CRISPR-sgRNA或質(zhì)粒載體來特異性調(diào)控IGF2BP3在RCC細(xì)胞系以及異種移植瘤模型中的表達(dá)，并驗(yàn)證IGF2BP3增加了RCC的惡性進(jìn)展(圖1E-I)。
圖1 IGF2BP3是RCC的潛在生物標(biāo)志物，并能促進(jìn)RCC的進(jìn)展
接下來，研究人員在RCC細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了IGF2BP3對m6A修飾的識別能力，因?yàn)?quot;GGAC"基序在RIP樣本中大部分富集(圖2A-B)。研究人員將RCC細(xì)胞的RIP-Seq數(shù)據(jù)與RCC組織的circRNA測序數(shù)據(jù)取交集。篩選出circRARS是RCC細(xì)胞中可能與IGF2BP3結(jié)合的circRNA(圖2C-J)。
圖2 IGF2BP3可識別N6-甲基腺苷(m6A)修飾位點(diǎn)并與circRARS結(jié)合
隨后，研究人員通過截斷質(zhì)粒與體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了IGF2BP3與circRARS的特異性結(jié)合位點(diǎn)，位于IGF2BP3的KH1-KH2結(jié)構(gòu)域(圖3)。并發(fā)現(xiàn)IGF2BP3/circRARS復(fù)合體通過m6A的方式調(diào)控下游分子(CAPN15,CD44,HMGA2,TNRC6A和ZMIZ2)的RNA穩(wěn)定性，并構(gòu)建過表達(dá)circRARS RCC細(xì)胞(circRARS慢病毒購自Genomeditech)，通過一系列挽救實(shí)驗(yàn)證實(shí)了復(fù)合體的調(diào)控作用(圖4-6)。最后，研究人員通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)IGF2BP3/circRARS對于RCC進(jìn)展的促進(jìn)作用。
圖3 circRARS通過其12-nt RNA序列與IGF2BP3的KH1-KH2結(jié)構(gòu)域相互作用
圖4 circRARS參與RCC分子機(jī)制圖解
綜上所述，IGF2BP3和circRARS通過KH1-KH2結(jié)構(gòu)域和12-nt序列(GUCUUCCAGCAA)相互作用，增加了IGF2BP3對m6A的識別，從而增加了CAPN15, CD44, HMGA2, TNRC6A和ZMIZ2等靶基因的mRNA穩(wěn)定性，促進(jìn)了RCC的進(jìn)展。IGF2BP3有望成為治療RCC的新靶點(diǎn)。
吉滿助力
本研究中所用的IGF2BP3、circRARSWT和M12過表達(dá)質(zhì)粒、circRARS過表達(dá)慢病毒均由吉滿生物提供。 了解更多質(zhì)粒構(gòu)建,病毒包裝,穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建,敲除細(xì)胞株,報告基因檢測等相關(guān)服務(wù)。歡迎訪問吉滿生物官網(wǎng)：m.zxpdf.cn 免費(fèi)咨詢電話：400-627-9288 文章來源：課題組供稿 文獻(xiàn)原文 原文引用 "IGF2BP3 cDNA was purchased from Genomeditech (Shanghai) and cloned into p3 FLAG-CMV -10 vector to construct the overexpression plasmid. circRARS wild-type (circRARSWT) and circRARS-M12 plasmid were synthesised and purchased from Genomeditech (Shanghai). Truncations of IGF2BP3 were amplified with primers, as shown in Table S3, and were cloned into p3×FLAG-CMV-10 vector. Lipofectamine 3000 reagent (Invitrogen) was applied following the manufacturer’s protocols for transient transfection when RCC cells were at 50% confluence. Lentivirus (circRARS from Genomeditech)was added into RCC cells at 40% confluence. An amount of 5 μg/mL puromycin or 5 μg/mL blasticidin was used to screen stable cells."
