背景簡(jiǎn)介
質(zhì)粒是可獨(dú)立于染色體自行復(fù)制的環(huán)狀DNA，常見于原核細(xì)菌和真菌中，絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型，少部分為RNA型。
由于其人工性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)粒通常被稱為載體（vector）或構(gòu)建體（constructs）。細(xì)菌質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體。
質(zhì)粒載體的命名規(guī)則
所有載體名稱都以字母“p”開頭，代表質(zhì)粒“plasmid”，“p”字母后面是載體骨架的縮寫，2-4個(gè)大寫字母代表發(fā)明者、實(shí)驗(yàn)室名稱或者其他表型性狀。
常見質(zhì)粒載體名稱：
LV: Lentivirus，慢病毒載體
MMLV: MMLV retrovirus，MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒載體
AV: Adenovirus，腺病毒載體
AAV: Adeno-associated virus，腺相關(guān)病毒載體
慢病毒質(zhì)粒載體
在眾多工具載體中，慢病毒，由于其可以將外源片段隨機(jī)插入細(xì)胞基因組，可在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)目的基因，且免疫原性低、安全性高，是重要的基因操作工具。獲得慢病毒顆粒首先需要進(jìn)行慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建。
慢病毒載體質(zhì)粒有很多種，常用的包括pLVX、pCDH、pLenti等，不同的實(shí)驗(yàn)室或者研究者可能會(huì)選擇不同的載體。吉滿生物挑選了四種常見的慢病毒載體質(zhì)粒，對(duì)其適用的實(shí)驗(yàn)和研究進(jìn)行了一句話概括，讓您可以快速選擇合適您實(shí)驗(yàn)的載體質(zhì)粒~
pLKO.1
最常用的慢病毒載體質(zhì)粒之一，其中包含人類U6啟動(dòng)子和H1啟動(dòng)子，以及EGFP或RFP等標(biāo)記物。它是一種經(jīng)典的RNAi工具，可以用于基因敲除和RNAi研究。
pLenti-CMV-GFP
一種基于CMV啟動(dòng)子的慢病毒載體質(zhì)粒，可以用于高效表達(dá)融合蛋白和其他目的蛋白。它帶有EGFP標(biāo)簽，可以用于快速篩選成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
pLVX-Puro
一種基于CMV啟動(dòng)子的慢病毒載體質(zhì)粒，可以用于高效表達(dá)目的蛋白和RNAi工具。它帶有Puro標(biāo)記，可以用于快速篩選轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并通過藥物選擇增加穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量。
pCDH
這一系列載體是一種基于第三代慢病毒系統(tǒng)的載體，采用雙啟動(dòng)子設(shè)計(jì)，可同時(shí)控制外源基因和熒光蛋白表達(dá)，提高表達(dá)效率和穩(wěn)定性。同時(shí)有多種藥物篩選標(biāo)記和熒光標(biāo)記選擇。
載體選擇要素
質(zhì)粒圖譜
載體選擇需要結(jié)合其質(zhì)粒圖譜信息，質(zhì)粒圖譜是質(zhì)粒DNA序列的物理圖譜，包括質(zhì)粒的大小、篩選標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄及翻譯元件等信息，為我們選擇質(zhì)粒、了解質(zhì)粒特點(diǎn)及應(yīng)用提供了重要依據(jù)。
質(zhì)粒圖譜包含的四大要素：
復(fù)制起點(diǎn)(ori)：控制質(zhì)粒復(fù)制的起始點(diǎn)，決定了質(zhì)粒的宿主和拷貝數(shù)。
篩選標(biāo)記：多為抗生素抗性基因，用于檢測(cè)和篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。
多克隆位點(diǎn)區(qū)(MCS)：外源基因的插入位點(diǎn)。
其他元件：如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子/沉默子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)等，這些元件對(duì)于質(zhì)粒的表達(dá)和調(diào)控至關(guān)重要。
載體元件：
在進(jìn)行基因調(diào)控的載體構(gòu)建時(shí)，主要考慮到的載體元件有以下幾個(gè)：
1、啟動(dòng)子
啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確的結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。啟動(dòng)子主要分為廣譜啟動(dòng)子和特異性啟動(dòng)子。
廣譜啟動(dòng)子為在各種組織、細(xì)胞上廣泛表達(dá)的啟動(dòng)子。
常用廣譜啟動(dòng)子有CAG，CMV，EF1a，PGK等，屬于Ⅱ型啟動(dòng)子，用于啟動(dòng)常規(guī)基因的表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)度不限，編碼與否不限。還包含啟動(dòng)RNA的Ⅲ型啟動(dòng)子，如U6和H1啟動(dòng)子，主要表達(dá)非編碼短序列RNA，如sgRNA、shRNA，連續(xù)4個(gè)或5個(gè)t為終止信號(hào)。
特異性啟動(dòng)子為在特異性組織或者細(xì)胞類型上表達(dá)的啟動(dòng)子。
常用特異性啟動(dòng)子如成熟神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子hSyn，投射神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子CaMKIIa，星型膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子GfaABC1D，心肌特異性啟動(dòng)子cTNT，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子TBG等。
2、熒光標(biāo)記
常用的熒光標(biāo)記有eGFP（綠色熒光蛋白）、ZsGreen1（綠色熒光蛋白）、mCherry（紅色熒光蛋白）、mScarlet（紅色熒光蛋白）。通過熒光蛋白的表達(dá)可以用于標(biāo)記細(xì)胞或標(biāo)記蛋白。
針對(duì)編碼蛋白，常規(guī)推薦目的基因和熒光蛋白非融合表達(dá)，通過熒光觀察感染效率。若需要用熒光標(biāo)記目的基因的位置，如亞細(xì)胞定位等實(shí)驗(yàn)時(shí)可考慮做目的基因和熒光蛋白融合表達(dá)。因蛋白均有自己的空間結(jié)構(gòu)，若選擇融合表達(dá)，兩個(gè)蛋白可能會(huì)相互影響。
3、抗性標(biāo)記
抗性基因是一種已知功能或已知序列的基因，能夠起著特異性標(biāo)記的作用。在基因工程意義上來說，它是重組DNA載體的重要標(biāo)記，通常用來檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化成功與否，如果抗性基因成功導(dǎo)入并表達(dá)基因，那么該生物就具有相應(yīng)的抗性，據(jù)此判斷基因表達(dá)載體是否成功導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。
常用原核抗性：Amp（氨芐青霉素抗性基因），Kan（卡那霉素抗性基因）。在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行搖菌抽提時(shí)，需要原核抗性進(jìn)行目的質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞篩選。
常用真核抗性：Puro（嘌呤霉素抗性基因），blasticidin（殺稻瘟菌素抗性基因），Neo（新霉素抗性基因），Zeo（博來霉素抗性基因），Hygro（潮霉素抗性基因）
其中Puro和blasticidin是較常用的真核抗性，真核抗性常用于穩(wěn)定株篩選等過程，具體使用抗性篩選的濃度可通過空細(xì)胞抗性預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，濃度梯度可根據(jù)抗生素說明書推薦濃度范圍設(shè)置。
4、蛋白標(biāo)簽（protein tag）
定義：與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤和純化等。
常見標(biāo)簽：3xFLAG，6xHis，HA，Myc，GST等。需注意目的蛋白是否有功能肽，如信號(hào)肽，前肽等，避免融合后對(duì)功能肽的表達(dá)產(chǎn)生影響。
5、其他
當(dāng)細(xì)胞中需要表達(dá)一個(gè)以上的基因時(shí)，可以使用連接元件，實(shí)現(xiàn)在單個(gè)載體上同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因的目的，且連接元件前后的序列為同一啟動(dòng)子表達(dá)，同時(shí)連接元件代替獨(dú)立啟動(dòng)子有助于減小質(zhì)粒長(zhǎng)度。
常用的兩種連接元件如下：
自剪切多肽2A(self-cleaving 2A peptide,2A)
平均長(zhǎng)度為18-22個(gè)氨基酸，2A上下游的基因同時(shí)轉(zhuǎn)錄，同時(shí)翻譯，翻譯后的肽段在2A的最后一個(gè)脯氨酸斷開，最終分別得到一個(gè)融合有2A肽尾巴的上游蛋白和一個(gè)N端帶有一個(gè)脯氨酸的下游蛋白。
優(yōu)點(diǎn)：2A肽結(jié)構(gòu)短小并且上下游基因的表達(dá)平衡性好；
缺點(diǎn)：不同基因不同細(xì)胞中2A斷裂效率有所不同。
內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site,IRES)
IRES元件具有不依賴帽子結(jié)構(gòu)而獨(dú)立募集核糖體的功能進(jìn)而可以啟動(dòng)下游基因的翻譯。處在IRES元件上下游的兩個(gè)基因同時(shí)轉(zhuǎn)錄，獨(dú)立翻譯，最終得到兩個(gè)獨(dú)立的蛋白。
優(yōu)點(diǎn)：獨(dú)立翻譯，進(jìn)而可以表達(dá)得到完整的目的蛋白；
缺點(diǎn)：IRES的結(jié)構(gòu)較大，其應(yīng)用常受到載體容量的限制，并且IRES對(duì)下游基因翻譯起始能力相對(duì)較弱，因此經(jīng)常為保證目的基因的表達(dá)，將熒光蛋白放在IRES下游，可能會(huì)導(dǎo)致熒光偏弱。
根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需求，選擇合適的啟動(dòng)子、熒光標(biāo)記，抗性標(biāo)記等，進(jìn)行慢病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建，再使用合適的慢病毒包裝體系進(jìn)行慢病毒包裝，得到所需的慢病毒顆粒應(yīng)用于細(xì)胞感染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建。
慢病毒包裝
所謂慢病毒包裝，即將生產(chǎn)病毒所需的組件拆分為多個(gè)質(zhì)粒（第2代系統(tǒng)為3個(gè)，第3代系統(tǒng)為4個(gè)），質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到包裝用的細(xì)胞（HEK293T）中，進(jìn)而產(chǎn)生慢病毒顆粒。
為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，在細(xì)胞中表達(dá)質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒分別表達(dá)出病毒的遺傳信息和蛋白，進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，通過超速離心的方式進(jìn)行慢病毒濃縮，得到高滴度的慢病毒濃縮液。
目前常用的慢病毒包裝系統(tǒng)主要分兩類：
第二代慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)
表達(dá)質(zhì)粒：pLVX-Puro、pLVX-IRES-Puro、pLVshRNA-EGFP(2A)Puro
包裝質(zhì)粒：pSPAX2、pMD2.G
第三代慢病毒四質(zhì)粒系統(tǒng)
表達(dá)質(zhì)粒：pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro、pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro
包裝質(zhì)粒：pLP1、pLP2、pLP-VSVG
病毒包裝服務(wù)
吉滿生物致力于病毒包裝，可提供一系列慢病毒現(xiàn)貨產(chǎn)品（包括過表達(dá)、永生化、iPS、自噬、CRE、亞細(xì)胞定位等）以及慢病毒包裝服務(wù)。
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