研究背景
2型糖尿?。═2D）是全球最常見(jiàn)的糖尿病類型，約占全球5.37億糖尿病病例的90%。
T2D的一個(gè)主要特征是胰島炎癥，這種炎癥反應(yīng)在β細(xì)胞功能障礙中起著關(guān)鍵作用。胰島內(nèi)的炎癥細(xì)胞、分子和細(xì)胞因子在引發(fā)和維持胰島炎癥過(guò)程中著重要作用，這些因素在T2D的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要。盡管目前已有一些基于細(xì)胞因子的治療策略取得了一定進(jìn)展，但針對(duì)具體分子的靶向治療仍處于空白階段，因此亟需開(kāi)發(fā)新的分子靶點(diǎn)和治療方案。
免疫檢查點(diǎn)分子在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、維持免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)的研究表明，免疫檢查點(diǎn)分子不僅在免疫細(xì)胞中發(fā)揮作用，也在胰島β細(xì)胞中表達(dá)，并參與調(diào)控胰島素分泌等代謝過(guò)程。
B7-H4（也稱為B7x或VTCN1）是一個(gè)典型的免疫檢查點(diǎn)分子，它通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性來(lái)調(diào)控免疫反應(yīng)。此外，B7-H4的基因多態(tài)性與T2D的發(fā)生密切相關(guān)，這提示B7-H4可能在調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能及T2D的發(fā)病過(guò)程中起到重要作用。
文獻(xiàn)來(lái)源
近日，上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院和上?？萍即髮W(xué)iHuman研究所夏芳珍教授、陸穎理教授和劉艷教授合作在 Molecular Metabolism （影響因子 7.0）上發(fā)表了“免疫檢查點(diǎn)分子B7-H4通過(guò)Stat5信號(hào)通路調(diào)節(jié)膽固醇代謝從而調(diào)節(jié)β細(xì)胞數(shù)量和胰島素分泌（The immune checkpoint molecule B7-H4 regulates β-cell mass and insulin secretion by modulating cholesterol metabolism through Stat5 signalling）”的研究論文。
該研究發(fā)現(xiàn)，免疫檢查點(diǎn)分子B7-H4是β細(xì)胞維持胰島免疫穩(wěn)態(tài)和正常功能的重要分子，調(diào)節(jié)β細(xì)胞的質(zhì)量和胰島素的加工和分泌。B7-H4通過(guò)下調(diào)Stat5信號(hào)，上調(diào)Apof的表達(dá)，進(jìn)而增加β細(xì)胞膽固醇流出和葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌。
項(xiàng)目研究
首先，作者通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選出6個(gè)在2型糖尿病患者中表達(dá)顯著改變的免疫檢查點(diǎn)基因（其中包括B7-H4）。研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4的表達(dá)在肥胖及db/db小鼠的胰島中顯著升高，并且與胰島β細(xì)胞共表達(dá)。進(jìn)一步利用小鼠Min6細(xì)胞系，作者發(fā)現(xiàn)IL-1β和高糖環(huán)境均能顯著誘導(dǎo)B7-H4的表達(dá)水平升高。
Fig.1 B7-H4在T2D β細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)
為了研究B7-H4在胰島β細(xì)胞中的生理功能及其是否參與T2D的病理過(guò)程，作者構(gòu)建了胰島β細(xì)胞特異性敲除的B7-H4小鼠（B7-H4 cKO）。通過(guò)對(duì)普食和高脂飲食喂養(yǎng)的cKO小鼠與對(duì)照Flox小鼠進(jìn)行比較，研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4敲除小鼠的葡萄糖耐量顯著下降，但胰島素敏感性未見(jiàn)顯著變化。
為了評(píng)估小鼠的胰島素分泌功能，作者進(jìn)行了體內(nèi)和體外的葡萄糖刺激胰島素分泌試驗(yàn)（GSIS）。結(jié)果表明，與Flox小鼠相比，cKO小鼠的胰島素分泌能力顯著受損。
Fig.2 胰島β細(xì)胞中敲除B7-H4
損害葡萄糖耐量和胰島素分泌
β細(xì)胞的數(shù)量和功能決定了血液中的胰島素水平。為了探討胰島素分泌受損是否與β細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān)，作者通過(guò)免疫染色分析了小鼠胰島的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，cKO小鼠胰腺體部，特別是尾部的胰島數(shù)量顯著減少，同時(shí)，cKO小鼠胰腺尾部的β細(xì)胞面積也明顯縮小，胰島Ins-1與Ins-2 mRNA水平的下降進(jìn)一步證明了cKO小鼠胰島β細(xì)胞數(shù)量減少。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，胰島中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase 3和Bax的表達(dá)水平上升，而抗凋亡基因Bcl2的表達(dá)水平下降，提示B7-H4可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡進(jìn)程來(lái)影響β細(xì)胞數(shù)量。
此外，透射電子顯微鏡的觀察結(jié)果顯示，cKO小鼠的β細(xì)胞內(nèi)囊泡體積顯著縮小，且囊泡與質(zhì)膜的距離明顯增大。cKO小鼠中，參與胰島素分泌囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的基因（Rab3a）以及啟動(dòng)胰島素分泌的基因（Snap25、Vamp2）表達(dá)顯著降低。上述結(jié)果表明，B7-H4不僅影響β細(xì)胞的數(shù)量，還影響其功能。
Fig3 B7-H4 c KO小鼠B細(xì)胞質(zhì)量和
胰島素的加工和分泌受損
在Flox小鼠中，作者通過(guò)使用AAV2/8-Ins2-B7H4病毒載體及對(duì)照病毒，特異性地在β細(xì)胞中過(guò)表達(dá)B7-H4。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)B7-H4顯著改善了小鼠的葡萄糖耐受性和胰島素分泌。這進(jìn)一步表明，B7-H4參與了β細(xì)胞功能和數(shù)量的調(diào)節(jié)，并可能成為改善β細(xì)胞功能的潛在分子。
Fig.4 胰島β細(xì)胞中過(guò)表達(dá)B7 - H4
可改善葡萄糖耐量和胰島素分泌
為了進(jìn)一步探討B(tài)7-H4發(fā)揮保護(hù)作用的具體分子機(jī)制，作者對(duì)cKO小鼠、Flox小鼠以及注射了AAV2/8-Ins2-B7H4或AAV2/8-Ctrl病毒的小鼠胰島進(jìn)行了RNA測(cè)序分析。結(jié)果顯示，cKO和Flox小鼠的差異表達(dá)基因（DEGs）主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路和鈣信號(hào)通路等方面。
AAV2/8-Ins2-B7H4與AAV2/8-Ctrl小鼠的DEGs富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、糖尿病中的AGE-RAGE信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路以及膽固醇代謝通路中。GSEA分析結(jié)果顯示，B7-H4 cKO小鼠的高爾基體到質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)和胰島素分泌途徑下調(diào)，而B(niǎo)7-H4過(guò)表達(dá)小鼠的胰腺分泌和胰島素分泌途徑正向調(diào)控上調(diào)。此外，B7-H4過(guò)表達(dá)還挽救了在高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)的肥胖小鼠中β細(xì)胞成熟標(biāo)志物、胰島素合成與分泌相關(guān)基因以及胰島內(nèi)分泌細(xì)胞形成相關(guān)基因的表達(dá)異常。
Fig.5 胰島的RNA-seq表明B7-H4改變了胰島β細(xì)胞功能和胰島素分泌標(biāo)志物的表達(dá)
作者對(duì)B7-H4 cKO小鼠和B7-H4過(guò)表達(dá)小鼠的胰島差異基因進(jìn)行了共同分析，發(fā)現(xiàn)有75個(gè)基因在cKO小鼠中表達(dá)顯著改變，而在過(guò)表達(dá)小鼠中則表達(dá)被逆轉(zhuǎn)。對(duì)這75個(gè)基因的功能分析表明，它們的功能主要富集在細(xì)胞粘附、膽固醇代謝和細(xì)胞因子受體活性等方面。KEGG富集分析進(jìn)一步顯示，JAK-STAT信號(hào)通路和鈣信號(hào)通路也富集其中。
先前的研究表明，β細(xì)胞中的膽固醇含量會(huì)顯著影響β細(xì)胞的囊泡和胰島素含量。作者發(fā)現(xiàn)，cKO小鼠胰島中的膽固醇濃度顯著升高，而B(niǎo)7-H4過(guò)表達(dá)顯著降低了高脂飲食（HFD）小鼠胰島中的膽固醇濃度。
為了探討這一現(xiàn)象的分子機(jī)制，作者利用GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中的人類胰腺RNA-seq數(shù)據(jù)，根據(jù)B7-H4的表達(dá)水平將樣本分為高表達(dá)組（表達(dá)水平前25%）和低表達(dá)組（表達(dá)水平后25%）。然后，將兩組的差異基因與先前發(fā)現(xiàn)的75個(gè)基因進(jìn)行共同分析，結(jié)果顯示Apof是在人類和小鼠中共同受B7-H4調(diào)控的基因。
為了研究B7-H4是否通過(guò)Apof調(diào)節(jié)胰島素分泌，作者在cKO和Flox小鼠的胰腺導(dǎo)管內(nèi)注射了AAV2/8-Apof-3xFlag或AAV2/8-GFP對(duì)照病毒，促使胰腺中過(guò)表達(dá)Apof。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Apof顯著改善了cKO小鼠的糖耐量和胰島素分泌，同時(shí)顯著降低了cKO小鼠血清和胰島內(nèi)的膽固醇含量，減少了β細(xì)胞中滯留的囊泡數(shù)量。這些囊泡更小，且更靠近質(zhì)膜，提示Apof改善了胰島素分泌囊泡的分泌功能。
Fig.6 B7 - H4通過(guò)調(diào)節(jié)胰島膽固醇代謝維持胰島β細(xì)胞功能和胰島素分泌
先前的研究表明，B7-H4可能參與胰島免疫微環(huán)境的調(diào)控。為了進(jìn)一步探討這一機(jī)制，作者采用液相芯片法（Luminex）進(jìn)行多因子檢測(cè)，測(cè)量了小鼠血清中細(xì)胞因子的濃度。
結(jié)果顯示，cKO小鼠血清中MDC/CCL22、eotaxin/CCL11、KC/CXCL1、TARC/CCL17、IFN-γ、MIP-1α/CCL3和MCP-3/CCL7的濃度較高，而CTACK/CCL27、IP-10/CXCL10、IL-2、I-309/CCL1、IL-1β和IL-4的濃度較低。組間差異分析顯示，cKO小鼠血清中TARC/CCL17顯著升高，而CTACK/CCL27顯著降低。qPCR結(jié)果進(jìn)一步表明，cKO小鼠胰島中CCL17、CCL27、IL-4、IL-6、CCR4和CCR10的表達(dá)水平上升。以上數(shù)據(jù)表明，B7-H4可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些細(xì)胞因子的表達(dá)，參與胰島免疫微環(huán)境的調(diào)控。
Fig.7 B7-H4調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá),參與胰島免疫微環(huán)境的調(diào)控
細(xì)胞因子可能通過(guò)激活JAK-STAT信號(hào)通路，參與B7-H4對(duì)胰島β細(xì)胞功能和胰島素分泌的調(diào)控。作者發(fā)現(xiàn)，cKO小鼠中Stat5的磷酸化水平顯著升高，而B(niǎo)7-H4過(guò)表達(dá)小鼠中Stat5磷酸化水平則顯著降低。
為了探討B(tài)7-H4是否通過(guò)Stat5調(diào)節(jié)胰島膽固醇代謝和胰島素分泌，作者使用Stat5抑制劑pimozide或?qū)φ赵噭╒C）處理cKO小鼠2周。結(jié)果顯示，pimozide顯著降低了cKO小鼠胰島中Stat5的磷酸化水平，增加了Apof蛋白的表達(dá)水平，并顯著改善了cKO小鼠的葡萄糖處理能力和胰島素分泌功能。同時(shí)，pimozide也顯著降低了cKO小鼠胰島中的膽固醇水平。
Fig.8 B7 - H4通過(guò)Stat5信號(hào)通路調(diào)節(jié)胰島膽固醇代謝
研究結(jié)論
綜上，該研究發(fā)現(xiàn)，免疫檢查點(diǎn)分子B7 - H4通過(guò)Stat5信號(hào)通路調(diào)節(jié)膽固醇代謝，從而調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞數(shù)量和胰島素分泌，為T2D的治療提供了潛在的分子靶點(diǎn)。
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