骨肉瘤（osteosarcoma）是一種由原始間充質(zhì)細胞形成的致命原發(fā)性骨骼腫瘤，具有高轉(zhuǎn)移潛能，很容易轉(zhuǎn)移到肺部，然后轉(zhuǎn)移到身體其他器官。骨肉瘤的高轉(zhuǎn)移潛力與低生存率相關，發(fā)生轉(zhuǎn)移性的患者5年生存率為20%。即使采用最佳誘導治療，30-40%的骨肉瘤患者復發(fā)率仍達80%，且極易在肺部復發(fā)。因此亟待明確轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的分子機制，以便開發(fā)有效的治療干預措施。
中國醫(yī)科大學醫(yī)學院等發(fā)表在International Journal of Biological Sciences雜志中題為：Apelin promotes osteosarcoma metastasis by upregulating PLOD2 expression via the Hippo signaling pathway and hsa_circ_0000004/miR-1303 axis的研究，探究了促進骨肉瘤轉(zhuǎn)移的分子機制，即一種脂肪因子Apelin (APLN)通過Hippo信號通路與hsa_circ_0000004/miR-1303信號軸上調(diào)PLOD2的表達，從而促進人骨肉瘤細胞的遷移。
細胞外基質(zhì)（ECM）的轉(zhuǎn)化在骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移中起著關鍵作用，其主要成分膠原蛋白，為ECM的組裝提供了支架。膠原蛋白的交聯(lián)和沉積依賴于PLOD家族，部分研究顯示PLOD2在多種腫瘤中高表達，參與膠原交聯(lián)、膠原纖維互作和腫瘤運動等。Apelin(APLN)是G蛋白偶聯(lián)受體Aplin受體(APJ)的內(nèi)源性配體之一，是一種具有廣泛生理學功能的內(nèi)源性多肽，參與調(diào)節(jié)腫瘤增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移，能量代謝等生理學過程，見于非小細胞肺癌、卵巢癌和膽管癌等多種癌癥，這也表明APLN在癌癥轉(zhuǎn)移中起著關鍵作用，然而APLN和PLOD2是否影響骨肉瘤的遷移，作者展開了如下研究。
圖1 人骨肉瘤組織中APLN的臨床病理特征 圖2 APLN與PLOD2在人骨肉瘤組織中的表達呈正相關 作者進一步研究了骨肉瘤轉(zhuǎn)移與APLN和PLOD2的作用機制，通過Transwell試驗、qPCR和Western blot分別檢測體外遷移活性、PLOD2 mRNA和蛋白的表達，證實了APLN劑量依賴性地促進骨肉瘤細胞的遷移，APLN通過刺激骨肉瘤細胞（143B和MG-63）使得PLOD2 mRNA和蛋白表達顯著增加。在PLOD2抑制劑（米諾地爾）預處理或轉(zhuǎn)染PLOD2 siRNA的情況下，對APLN促遷移的作用產(chǎn)生了抑制。也就是說，在骨肉瘤中，APLN通過增加PLOD2的表達來促進細胞遷移。 圖3 APLN通過增加PLOD2表達促進骨肉瘤細胞遷移 為了探究更深入的機制作用，作者參考了在腫瘤轉(zhuǎn)移中可發(fā)揮重要作用并與骨肉瘤相關的PI3K/Akt/mTOR、NF-κB、JAK/STAT、Hippo和缺氧信號通路。通過qPCR檢測可推斷Hippo信號通路參與了APLN誘導的骨肉瘤細胞遷移的過程。利用小干擾抑制Hippo通路關鍵分子MST1和MOB1表達后，可顯著抑制APLN對細胞遷移活動的影響，以及PLOD2 mRNA和蛋白表達水平。該部分結果說明了MST1/MOB1通路參與APLN誘導骨肉瘤細胞遷移并增加PLOD2的表達。 圖4 Hippo信號通路參與APLN誘導的PLOD2 mRNA表達 圖5 MST1/MOB1通路參與APLN誘導骨肉瘤細胞遷移并增加PLOD2的表達 YAP作為Hippo通路的主要下游效應分子，其激活可調(diào)控與增殖、轉(zhuǎn)移相關基因表達。使用YAP抑制劑及YAP siRNA實施阻斷后，APLN對細胞遷移的影響變?nèi)?，PLOD2 mRNA和蛋白的表達降低。此外，采用ChIP和qPCR驗證了YAP與PLOD2啟動子的調(diào)控互作。 圖6 YAP通路與APLN誘導的骨肉瘤細胞遷移有關，并增加PLOD2的表達 miRNAs能夠通過結合mRNA的3’-UTR調(diào)控蛋白編碼基因，在人類癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。為此進一步檢索得到5個與PLOD2的3'-UTR結合miRNAs（miR-330-3p、miR-513a-3p、miR-944、miR-1303和miR-1305），其中miR-1303經(jīng)APLN處理驗證顯示表達明顯降低，且miR-1303水平受到濃度依賴的抑制；與正常骨組織相比，miR-1303在人骨肉瘤組織中的表達明顯下調(diào)；且miR-1303 mimic可以消除APLN誘導的細胞遷移和PLOD2表達的促進。此外，雙熒光素酶報告基因檢測驗證了APLN與PLOD2可以直接相互作用。 圖7 APLN通過下調(diào)miR-1303的表達，增強PLOD2的表達并促進骨肉瘤細胞遷移 環(huán)狀RNA(circular RNAs)被認為是miRNA的海綿，導致miRNA功能受到抑制。經(jīng)由環(huán)狀RNA相互作用體分析，作者預測得到circ_0078767、circ_0094088、circ_0000004、circ_0000003、circ_0000051和circ_0000090可與miR-1303產(chǎn)生結合，且驗證發(fā)現(xiàn)其中circ_0000004在骨肉瘤細胞中表達量最高。為了進一步明確circ_0000004和miR-1303對骨肉瘤細胞的作用機制，作者使用了小干擾抑制、熒光素酶報告基因檢測、Pull-down試驗及mRNA測定，證實了APLN通過上調(diào)circ_0000004抑制miR-1303的表達，進而解除對下游靶基因PLOD2的抑制作用，促進骨肉瘤細胞的遷移能力。 圖8 APLN通過上調(diào)miR-1303的circ_0000004海綿作用來增強骨肉瘤細胞遷移，并增加PLOD2的表達 為了進一步證實APLN在體內(nèi)對骨肉瘤細胞遷移和PLOD2表達的影響，作者建立了穩(wěn)定表達APLN shRNA細胞系，通過Western blot，生物發(fā)光成像監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移情況及免疫組化染色分別進行檢測，結果顯示APLN shRNA細胞系中APLN和PLOD2蛋白表達明顯受到抑制，細胞遷移顯著減少，APLN敲除能夠顯著抑制肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。 圖9 敲除APLN可抑制肺轉(zhuǎn)移 綜上所述，作者研究表明APLN通過Hippo信號通路以及hsa_circ_0000004/miR-1303軸促進PLOD2的表達和人骨肉瘤細胞的遷移，推斷APLN是轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的一個有希望的靶點。 圖10 圖示骨肉瘤轉(zhuǎn)移中APLN的參與過程 吉滿助力 吉滿生物（Genomeditech）可提供文章中涉及的不同形式質(zhì)粒構建、報告基因檢測和功能表型（CCK-8增殖，遷移和侵襲）、WB等相關服務內(nèi)容，歡迎訪問吉滿生物官方網(wǎng)站：m.zxpdf.cn，咨詢電話：400-627-9288 021-50432825
