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研究背景

吡那地爾是一種抗高血壓藥物，可以直接放松血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)，促進(jìn)外周血管舒張。有研究表明吡那地爾預(yù)處理可以冠狀動(dòng)脈舒張，保護(hù)缺血心臟免受再灌注損傷。

心臟微血管缺血再灌注損傷是一種與心臟疾病相關(guān)的嚴(yán)重并發(fā)癥。相當(dāng)一部分患者在經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)后出現(xiàn)心臟微血管功能障礙，導(dǎo)致心肌再灌注無效，加劇心肌損傷，導(dǎo)致重大心血管不良事件發(fā)生。吡那地爾除了具有松弛 VSMC 的作用外，對內(nèi)皮細(xì)胞在心血管損傷中的機(jī)制尚未進(jìn)行研究?？紤]到內(nèi)皮細(xì)胞是心臟微血管的解剖和功能基礎(chǔ)，研究吡那地爾在內(nèi)皮細(xì)胞和心血管保護(hù)中的作用具有重要意義。

文獻(xiàn)來源

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院陳章煒、錢菊英和葛均波院士團(tuán)隊(duì)在期刊《Basic Research in Cardiology》上發(fā)表題為“Pinacidil ameliorates cardiac microvascular ischemia–reperfusion injury by inhibiting chaperone-mediated autophagy of calreticulin”的研究論文，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)吡那地爾治療和 CRT 過表達(dá)均對心臟微血管 I/R 損傷具有保護(hù)作用，吡那地爾直接與 HSP90 結(jié)合，通過 HSP90 抑制 CRT 分子伴侶介導(dǎo)的自噬 (CMA) 降解， 從而維持線粒體鈣穩(wěn)態(tài)，最終保護(hù)心臟微血管減輕 I/R 損傷。這些發(fā)現(xiàn)揭示了吡那地爾心血管保護(hù)的新機(jī)制，并提示CRT/鈣超載/線粒體凋亡信號通路是內(nèi)皮損傷的潛在病理機(jī)制。

研究結(jié)果

首先，研究人員對術(shù)后的假手術(shù)組、I/R損傷組和I/R+吡那地爾組（0.1和0.5 mg/kg/天）小鼠進(jìn)行了超聲檢查心臟功能發(fā)現(xiàn)，吡那地爾治療可以有效改善I/R損傷造成的心臟功能障礙。接下來，研究人員使用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、WB和TTC染色等組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，吡那地爾給藥顯著減少了I/R損傷后的心臟的梗死面積、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡損傷和心室重塑，這些結(jié)果表明，吡那地爾治療至少部分可以通過改善心臟細(xì)胞凋亡來減輕缺血再灌注引起的心臟功能障礙和重塑。

圖1  吡那地爾給藥可改善 I/R 小鼠模型的心臟功能

血管血液灌注在心臟修復(fù)中發(fā)揮重要作用。因此，研究人員為了確定吡那地爾在 I/R 損傷后血管功能中的具體作用。使用硫代黃素-S染色測量未回流區(qū)域發(fā)現(xiàn)，吡那地爾可以有效改善I/R損傷帶來的左心室缺損，增加毛細(xì)血管密度和灌注情況，減輕無復(fù)流現(xiàn)象。研究人員還發(fā)現(xiàn) I/R 損傷后導(dǎo)致心臟微血管中 NO 生成顯著減少、內(nèi)皮素 1(ET-1)表達(dá)上調(diào)、內(nèi)皮 NO 合酶(eNOS)表達(dá)下調(diào)以及磷酸化。WB驗(yàn)證、免疫熒光實(shí)驗(yàn)和蛋白泄露實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，吡那地爾可以明顯改善I/R損傷帶來的內(nèi)皮屏障功能障礙和內(nèi)皮依賴性炎癥來保護(hù)微血管功能免受心臟缺血再灌注損傷。

圖2  吡那地爾治療可減輕I/R損傷小鼠模型中的心臟微血管功能障礙

為了闡明吡那地爾在內(nèi)皮保護(hù)中的潛在機(jī)制，研究者對OGD/R 損傷后 HCMEC 的細(xì)胞進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)OGD/R 損傷后HCMEC細(xì)胞凋亡能力顯著增強(qiáng)，與線粒體相關(guān)凋亡蛋白Bax、Caspase 9和cleaved-Caspase 3表達(dá)顯著增加，同時(shí)會(huì)釋放細(xì)胞色素C(Cyt-C)到細(xì)胞質(zhì)中，吡那地爾治療可以有效改善OGD/R損傷對HCMEC細(xì)胞影響。

與體內(nèi)研究結(jié)果一致，吡那地爾給藥還可以很大程度恢復(fù)由于OGD/R損傷導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基中NO的含量以及eNOS表達(dá)和磷酸化的降低，并且明顯減輕了內(nèi)皮炎癥反應(yīng)、FITC-BSA滲漏和改善β-catenin 和 VE-cadherin的強(qiáng)度和形態(tài)，以上結(jié)果表明吡那地爾可以部分通過抑制線粒體依賴性細(xì)胞凋亡，對內(nèi)皮保護(hù)的有益作用。

圖3  吡那地爾可改善OGD/R損傷中的HCMEC功能和存活率

對OGD/R 損傷的 HCMEC 進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序分析，GO注釋結(jié)果顯示DEG主要富集在與線粒體功能、ER應(yīng)激途徑和鈣相關(guān)途徑通路中。于是研究人員通過實(shí)時(shí)鈣信號報(bào)告基因 GCaMP8 記錄鈣超載情況，發(fā)現(xiàn)I/R損傷后中小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞的鈣超載被激活，吡那地爾可以顯著降低 I/R 心臟中的熒光強(qiáng)度。鈣穩(wěn)態(tài)主要由鈣通道成員以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的穿梭調(diào)節(jié)，因此研究人員檢測發(fā)現(xiàn) OGD/R 損傷的 HCMEC 中膜鈣通道調(diào)節(jié)因子 MCU 和 IP3R 水平顯著升高，同時(shí)降低線粒體鈣水平的 SERCA2 表達(dá)水平顯著降低，而吡那地爾治療可明顯逆轉(zhuǎn)這種情況。此外，吡那地爾治療治療還可以顯著減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的重疊區(qū)域(稱為MAM)。綜上所述，吡那地爾對線粒體損傷的保護(hù)作用很大程度上取決于減少鈣從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到線粒體的穿梭，可能是通過調(diào)節(jié) MCU-IP3Rs-SERCA2 途徑和 MAM 形成。

圖4  吡那地爾治療可減少OGD/R損傷后的鈣超載

為了進(jìn)一步探索吡那地爾在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體鈣穿梭中潛在的分子機(jī)制。研究人員以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣緩沖劑CRT為著手點(diǎn)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OGD/R損傷上調(diào)CRT蛋白表達(dá)，吡那地爾給藥以劑量依賴性方式促進(jìn)CRT蛋白表達(dá)并增加小鼠I/R心臟血管內(nèi)皮中的CRT表達(dá)。不過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，吡那地爾治療并沒有增加OGD/R損傷后HCMEC細(xì)胞中CRT基因mRNA上調(diào)，因此，吡那地爾可能調(diào)節(jié) CRT 蛋白的穩(wěn)定性和降解。研究人員通過放線菌酮 (CHX) 處理發(fā)現(xiàn)，吡那地爾可在正常和 OGD/R 條件下維持 CRT 蛋白表達(dá)，表明吡那地爾抑制 CRT 蛋白降解。然后通過評估蛋白酶體和溶酶體抑制劑對CRT蛋白水平的變化，發(fā)現(xiàn)吡那地爾可以減少 OGD/R 損傷后 CRT 的自噬降解。DARTS(藥物親和響應(yīng)靶穩(wěn)定性)、LC-MS 分析和WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，吡那地爾可以直接結(jié)合HSP90，并且顯著降低溶酶體和細(xì)胞質(zhì)中CRT與HSP90之間的相互作用。因此，抑制 HSP90 介導(dǎo)的 CMA 降解 CRT 可能是吡那地爾對內(nèi)皮鈣穩(wěn)態(tài)有益的潛在分子機(jī)制之一。

圖5  吡那地爾抑制OGD/R 損傷中CRT的CMA

通過對HCMEC細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)CRT蛋白發(fā)現(xiàn)，CRT過表達(dá)對鈣超載沒有影響。然而，在OGD/R損傷后，CRT過表達(dá)保護(hù)HCMEC免受線粒體和細(xì)胞鈣超載的影響，顯示出與吡那地爾治療相同的結(jié)果，OGD/R損傷后，鈣通道IP3Rs和MCU被CRT過表達(dá)下調(diào)，表明從ER轉(zhuǎn)移到線粒體的鈣減少了。隨著線粒體膜電位的改善，表明CRT過表達(dá)可以改善線粒體功能障礙。線粒體功能改善后，檢測到線粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，OGD/R損傷后，CRT過表達(dá)限制Cyt-c釋放到細(xì)胞質(zhì)中，下調(diào)Bax和Caspase-9表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，表明CRT在線粒體相關(guān)細(xì)胞凋亡中的抑制作用。綜上所述，CRT 通過維持鈣穩(wěn)態(tài)、改善線粒體功能和抑制線粒體凋亡，對內(nèi)皮保護(hù)免受 OGD/R 損傷產(chǎn)生積極作用。

圖6  CRT 過表達(dá)可減輕OGD/R損傷的HCMEC中的鈣超載和線粒體功能障礙

為了進(jìn)一步驗(yàn)證CRT在內(nèi)皮鈣穩(wěn)態(tài)和心臟微血管保護(hù)中的作用，使用了AAV9介導(dǎo)的內(nèi)皮特異性CRT過表達(dá)小鼠模型。與前文吡那地爾治療結(jié)果相似，CRT過表達(dá)顯著降低了I/R損傷小鼠中GCaMP8的熒光強(qiáng)度，減少了內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)了毛細(xì)血管密度和灌注，并減輕了I/R損傷后的無復(fù)流現(xiàn)象，降低梗塞面積并改善了心臟功能。

圖7  內(nèi)皮特異性CRT過表達(dá)可減輕心臟微循環(huán)損傷并減少 I/R 損傷中的梗塞面積

綜上所述， 吡那地爾通過直接結(jié)合HSP90抑制CMA對CRT的降解。另外，上調(diào)CRT表達(dá)可通過IP3Rs/MCU信號通路抑制鈣超載誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和線粒體依賴性凋亡，最終改善內(nèi)皮功能和心臟微血管I/R損傷。