研究背景
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma,GBM) 是最常見和惡性的原發(fā)性腦腫瘤，中位生存期小于15個月，惡性程度高。膠質(zhì)瘤中重要的細(xì)胞，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSCs)，是一類可以自我更新、分化、維持腫瘤異質(zhì)性、與腫瘤生長和治療耐藥性緊密相關(guān)的細(xì)胞。闡明GSCs調(diào)控的分子機制將擴大我們對疾病的認(rèn)識，并為靶向GBMs的有效治療策略提供參考。
RNA修飾是控制轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基本機制。核糖2'-O-Me甲基化是人類rRNA中最豐富的修飾，有100多個位點被標(biāo)記。人rRNA 2'-O-Me由C/D box小核仁核糖核蛋白snoRNPs)復(fù)合物(介導(dǎo)，該蛋白復(fù)合物由C/D box snoRNA、甲基轉(zhuǎn)移酶原纖維蛋白(FBL)和RNA結(jié)合蛋白NOP58(NOP58核糖核蛋白)、NOP56和NHP2L19組成。rRNA修飾在核糖體的生物發(fā)生和致癌蛋白的翻譯調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，包括腫瘤發(fā)生過程中的細(xì)胞增殖、生存和轉(zhuǎn)化。然而，關(guān)于rRNA 2'-O-Me在癌癥干細(xì)胞，特別是GSCs中的作用，大家知之甚少。
文獻(xiàn)來源
2023年11月，中國科學(xué)院/中國科學(xué)院大學(xué)/北京神經(jīng)外科研究所/首都醫(yī)科大學(xué)/西湖大學(xué)/西湖實驗室與美國匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心研究團隊通過Nature Communications期刊在線發(fā)表了題為“LncRNA INHEG promotes glioma stem cell maintenance and tumorigenicity through regulating rRNA 2’-O-methylation”的研究論文 ，發(fā)現(xiàn)了一種GSC特異性的lncRNA INHEG，它與NOP58相互作用，促進NOP58 類泛素化修飾和下游rRNA 2'-o-甲基化。這一過程支持GSC自我更新和腫瘤發(fā)生，提供了對癌癥干細(xì)胞中rRNA甲基化的進一步了解，并為致命癌癥提供了潛在的治療靶點。
研究結(jié)果
rRNA 2'-o-甲基化參與GSCs的自我更新并發(fā)揮重要功能
為了研究rRNA甲基化在腫瘤層次中的作用，作者通過RiboMeth-seq技術(shù)檢測了人類患者來源的GSCs(3565和MGG4)和匹配的DGCs中rRNA 2'-OMe水平。
結(jié)果顯示，與分化的腫瘤細(xì)胞相比，rRNA 2'-O-Me以及C/D box snoRNP蛋白組分(含F(xiàn)BL, NOP56, NOP58和NHP2L1)在GSCs中都更豐富。進一步用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除了人類患者來源的GSCs中FBL和NOP58蛋白，減少了細(xì)胞生長和抑制了球體的形成；轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)差異表達(dá)基因分析表明，F(xiàn)BL或者NOP58調(diào)控的基因與癌癥增殖、低存活率、神經(jīng)干細(xì)胞和rRNA表達(dá)有關(guān)。也就是說，rRNA 2'-o-甲基化調(diào)控因子有助于GSC的自我更新和生長。
圖1 rRNA 2'-O-Me參與GSCs的自我更新
圖2 rRNA 2'-O-Me調(diào)節(jié)因子對GSCs的功能至關(guān)重要
LncRNA INHEG在GSCs中高表達(dá)，并與NOP58相互作用
由于NOP58被認(rèn)為是招募box C/D snoRNAs所需的RNA結(jié)合蛋白，于是作者使用紫外交聯(lián)免疫沉淀和RNA測序(uvRIP-seq)技術(shù)找到并鑒定了與NOP58相互作用的一種新的lncRNA—INHEG分子，由2個外顯子組成，長650bp，主要定位于細(xì)胞核，在GSCs中高表達(dá)。
圖3 LncRNA INHEG與NOP58相互作用，在GSCs中高度表達(dá)
隨后，作者探索了INHEG在GSC自新生維持中的細(xì)胞功能，沉默INHEG(CRISPRi)會抑制GSC的增殖，減少腫瘤球的形成；INHEG激活(CRISPRa)的GSCs的腫瘤球形成增加，表明INHEG促進GSC的增殖和自我更新。
圖4 INHEG促進GSCs的自我更新和膠質(zhì)瘤的發(fā)生
INHEG通過調(diào)控C/D box snoRNPs組裝和rRNA 2'-o甲基化狀態(tài)來調(diào)控多個癌基因的蛋白合成
INHEG與NOP58相互作用的觀察表明，INHEG可能調(diào)控snoRNP的組裝和功能。
為了探討INHEG在C/D box snoRNP生物發(fā)生中的作用，在INHEG下調(diào)和上調(diào)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中進行NOP58免疫沉淀，INHEG的轉(zhuǎn)錄抑制減弱了NOP58和NH2PL1之間的聯(lián)系，過表達(dá)INHEG加強了NOP58與NH2PL1和snoRNA相互作用的效率，從而促進了C/D box snoRNPs的形成。此外，過表達(dá)INHEG導(dǎo)致rRNAs 2'-O-methylation水平升高，沉默反之。
利用RNA-seq和核糖體分析(Ribo-seq)技術(shù)進一步評估了INHEG對蛋白質(zhì)合成的影響。其中，INHEG過表達(dá)后提高了1000多個基因的翻譯效率，這些基因主要參與了腫瘤發(fā)生和干細(xì)胞特性。后續(xù)驗證中，檢測到INHEG激活增強了癌基因IGF1R、EGFR、CDK6和PDGFRB的蛋白表達(dá)，提示INHEG可能促進膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中癌基因的翻譯過程。
圖5 INHEG促進rRNA 2'-o-Me復(fù)合物的組裝，rRNA的2'-o-Me和蛋白質(zhì)從頭合成
INHEG相關(guān)蛋白TAF15與NOP58相互作用，并作為NOP58的SUMO2 E3連接酶
作者進一步構(gòu)建了生物素標(biāo)記探針，并通過RNA pull-down、質(zhì)譜(MS)聯(lián)合證實了INHEG與3個蛋白(TAF15、NOP56和NOP58)之間的相互作用。在這三者關(guān)系當(dāng)中，lncRNA INHEG通過結(jié)合NOP58和TAF15(作為SUMO2 E3連接酶)增強了TAF15-NOP58的相互作用，導(dǎo)致了NOP58的類泛素化。
圖6 INHEG增強了TAF15和NOP58之間的相互作用，并以TAF15依賴的方式調(diào)控NOP58的類泛素化修飾
rRNA 2' -O-Me調(diào)控因子促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生
為了探索rRNA 2'-o-me調(diào)節(jié)因子對體內(nèi)腫瘤生長的作用，通過FBL或NOP58敲除GSCs建立原位異種移植小鼠模型。與對照組相比，F(xiàn)BL或NOP58敲除的GSCs存活時間更長，腫瘤大小更小。與此同時，INHEG缺失的GSCs小鼠的生存時間更長，腫瘤質(zhì)量減少。INHEG激活顯示出更短的生存期，且腫瘤腫塊更大。
圖7 FBL、NOP56、NOP58和INHEG在膠質(zhì)瘤發(fā)生中的作用
綜上所述，本研究表明rRNA 2'-O-Me在GSCs的自我更新維持中是一個重要的事件。lncRNA INHEG不僅與NOP58相互作用，而且在GSCs中也高表達(dá)。INHEG通過增強TAF15與NOP58相互作用，以及C/D box RNP組裝、rRNA甲基化和蛋白質(zhì)的重新合成，進而促進GSCs下游的自我更新，從而促進NOP58 sumoylation。這一軸可能為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療提供了策略。
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文獻(xiàn)原文
https://doi.org/10.1038/s41467-023-43113-5
原文引用
"Lentiviral particles were collected 48h after media change and concentrated using the lentivirus concentrated kit (Genomeditech) according to the manufacturer’s instructions."
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