傳統(tǒng)的基因編輯工具主要包括一代ZFN、二代TALEN和三代CRISPR技術(shù)，ZFN與TALEN技術(shù)都是使用包含DNA識別結(jié)合域和DNA切割域的核酸酶，但存在靶標識別率低、成本高、脫靶概率高和結(jié)構(gòu)復雜等問題，因此，推動了三代CRISPR技術(shù)的發(fā)展。
ZFN | TALEN | CRISPR/Cas9 | |
靶點DNA序列的識別區(qū)域 | 鋅指(ZF)結(jié)構(gòu)域 | 重復可變雙殘基(RVD)的重復 | CRISPR RNA (crRNA) 或sgRNA |
DNA的剪切 | Fok1核酸酯結(jié)構(gòu)域 | Fok1核酸酯結(jié)構(gòu)域 | Cas9蛋白 |
識別靶點大小 | (9或12bp)*2 | (8-31bp)*2 | 20bp +NGG |
優(yōu)點 | 平臺成熟，效率高 | 設(shè)計較ZFN簡單，特異性高 | 靶向精確 |
設(shè)計構(gòu)建 | 最難 | 較難 | 容易 |
甲基化敏感程度 | 敏感 | 敏感 | 不敏感 |
脫靶效應 | 低 | 極低 | 稍高 |
切割效率 | 高 | 高 | 最高 |
（基因編輯工具對比）
CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成為基因編輯的有力工具，用于準確、高效地編輯生物體的基因組。在基因研究、基因治療和基因育種等方面展示出了巨大的應用前景。運用CRISPR技術(shù)實現(xiàn)基因編輯，需要將CRISPR/Cas9系統(tǒng)的兩個核心元素sgRNA和Cas9蛋白遞送到細胞內(nèi)，目前主要有三種遞送形式：
(1) 質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)：采用分別表達sgRNA和Cas9的DNA質(zhì)粒(或sgRNA和cas9共表達質(zhì)粒)共轉(zhuǎn)染細胞，在細胞內(nèi)通過質(zhì)粒瞬時表達gRNA和Cas9蛋白，進而實現(xiàn)對靶基因的編輯。
(2) RNA瞬轉(zhuǎn)：體外合成sgRNA和表達Cas9蛋白的mRNA，通過瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)將兩者遞送至細胞內(nèi)，Cas9的mRNA可由細胞翻譯合成Cas9蛋白，進而實現(xiàn)對靶基因編輯。
(3) 蛋白瞬轉(zhuǎn)(RNP)：體外將Cas9蛋白和sgRNA混合，二者可以結(jié)合形成核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)，然后通過瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)(脂質(zhì)體或電轉(zhuǎn)等)可將RNP復合效應物遞送到細胞內(nèi)，進而實現(xiàn)對靶基因的編輯。
根據(jù)遞送形式以及不同的細胞，可以選擇不同的遞送方法，主要包括：物理方法、化學方法、以及病毒轉(zhuǎn)導。其中，利用慢病毒轉(zhuǎn)導質(zhì)粒和電穿孔遞送RNP是將CRISPR/Cas9導入細胞的兩種主要方法。
CRISPR/Cas9技術(shù)的常規(guī)應用
基因敲除
在基因的上下游各設(shè)計一條向?qū)NA，將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)入細胞中，向?qū)NA通過堿基互補配對可以靶向PAM附近的目標序列，Cas9蛋白會使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。
生物體自身存在著DNA損傷修復的應答機制，在通常情況下，細胞會采用高效的非同源末端連接方式(NHEJ)對斷裂的DNA進行修復，會將斷裂上下游兩端的序列連接起來，從而實現(xiàn)了細胞中目標基因的敲除。
基因敲入、定點突變
在上下游DNA雙鏈斷裂基礎(chǔ)上，引入一個修復的模板質(zhì)(供體DNA分子)，基因組斷裂部分會依據(jù)修復模板進行同源重組修復(HDR)，細胞按照提供的模板在修復過程中引入片段插入或定點突變。
基因抑制、基因激活
Cas9的特點是能夠自主結(jié)合和切割目的基因，通過點突變的方式使Cas9的兩個結(jié)構(gòu)域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介導下結(jié)合靶基因，而不具備剪切DNA的功能。因此，將dCas9結(jié)合到基因的轉(zhuǎn)錄起始位點，可以阻斷轉(zhuǎn)錄的開始，從而抑制基因表達；將dCas9結(jié)合到基因的啟動子區(qū)域也可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制/活化物，使下游靶基因轉(zhuǎn)錄受到抑制或激活。因此dCas9與Cas9、Cas9 nickase的不同之處在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不會對基因組DNA造成永久性的改變。
多重編輯（Multiplex Editing）及功能基因組篩選
將多個sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到細胞中，可同時對多個基因進行編輯，具有基因組功能篩選作用。
利用CRISPR/Cas9進行基因編輯可以產(chǎn)生大量的基因突變細胞，因此利用這些突變細胞可以確認表型的變化是否是由基因或者遺傳因素導致的。目前CRISPR的基因組篩選功能應用于篩選對表型有調(diào)節(jié)作用的相關(guān)基因，如對化療藥物或者毒素產(chǎn)生抑制的基因、影響腫瘤遷移的基因以及構(gòu)建病毒篩選文庫對潛在基因進行大范圍篩選等。
高效的基因編輯工具 - Cas9核酸酶穩(wěn)定表達細胞系
Cas9蛋白的編碼框長達4kb，將Cas9基因高效導入細胞是應用CRISPR/cas9系統(tǒng)進行基因編輯的難點之一，Cas9基因的長度極大地限制了基因?qū)爰毎椒ǖ倪x擇以及基因敲除的實驗設(shè)計。
將Cas9核酸酶基因穩(wěn)定整合到指定的宿主細胞基因組上，保證該基因表達的可靠性以及持續(xù)性。為CRISPR/cas9基因組編輯應用提供一個方便、高效的工具。點擊了解產(chǎn)品
Cas9核酸酶穩(wěn)定表達細胞系應用
一、高通量篩選
sgRNA高通量篩選，功能驗證，確定sgRNA編輯效率；
二、基因編輯模型
轉(zhuǎn)染sgRNA或同時轉(zhuǎn)染sgRNA和供體DNA，實現(xiàn)基因敲除\基因敲入\點突變；
三、基因功能研究
可用于長期在某一類細胞中研究不同基因的生物學功能。
