背景簡介
永生化是一種細(xì)胞生物學(xué)術(shù)語。是指動(dòng)物細(xì)胞脫分化失敗，受到病毒感染，外源惡意代碼轉(zhuǎn)染，輻射或藥劑作用后，細(xì)胞分裂次數(shù)限制機(jī)制和DNA檢查-自毀機(jī)制失靈，導(dǎo)致細(xì)胞具有無限分裂生長的能力的過程成為細(xì)胞永生化。
（永生化原理圖）
不同的細(xì)胞永生化方法
HPV 可介導(dǎo)人的包皮細(xì)胞、角化上皮以及乳腺、胰導(dǎo)管和口腔等的上皮細(xì)胞永生化；
猿猴病毒的SV40大T抗原 (TAg)用于黏附細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等；
EBV 用于淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞；
端粒酶TERT 用于間充質(zhì)干細(xì)胞和其他一些細(xì)胞。
案例解析
赫特維希上皮根鞘(HERS)原代細(xì)胞永生化解決方案
Li et al. Stem Cell Research & Therapy(2019) 10:3
赫特維希上皮根鞘(Hertwig’s epithelial root sheath, HERS)細(xì)胞是一群在牙根發(fā)育以及牙周組織形成過程中發(fā)揮重要作用的特殊細(xì)胞。在牙根發(fā)育過程中，HERS通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化，并通過上皮-間充質(zhì)相互作用（EMI）誘導(dǎo)牙乳頭向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，在引導(dǎo)牙根形成中發(fā)揮重要作用。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：PN8大鼠
組織：第一下頜磨牙
分離原代細(xì)胞：解剖PN 8時(shí)下頜第一磨牙根尖區(qū)的Hertwig上皮根鞘，用2.4 U/mL分散酶和625 U/mL膠原酶解離組織（圖a）
培養(yǎng)條件：由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、2%胎牛血清、1%上皮細(xì)胞生長添加劑和1%青霉素/鏈霉素溶液組成
生長特性：貼壁，呈典型的鵝卵石樣外觀（圖b）
吉滿生物助力工具病毒
pGMLV-SV40T-PURO慢病毒
構(gòu)建永生化流程
01.用編碼猿猴病毒40大T抗原(SV 40 LT)和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒載體(pGMLV-SV 40 T-PURO,Genomeditech,Shanghai,China)轉(zhuǎn)染第1代純化的原代HERS細(xì)胞
02.轉(zhuǎn)染后，通過向培養(yǎng)基中補(bǔ)充2 μg/ml嘌呤霉素篩選細(xì)胞
03.使用有限稀釋法，將細(xì)胞分離為單細(xì)胞，并培養(yǎng)擴(kuò)增所選克隆
04.通過克隆形成細(xì)胞的篩選，共篩選出68個(gè)克隆，這些克隆可培養(yǎng)50代以上
永生化細(xì)胞特性與鑒定
其中，兩個(gè)細(xì)胞系命名為HERS-H1和HERS-C2，呈鵝卵石樣形態(tài)（圖d），是貼壁的，具有高增殖能力，倍增時(shí)間約為24小時(shí)（圖e）；
HERS細(xì)胞標(biāo)志物：細(xì)胞角蛋白14（CK14）、上皮鈣粘蛋白（E-cadherin）和間充質(zhì)波形蛋白（vimentin）均呈陽性表達(dá)，提示細(xì)胞同時(shí)具有上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的特征，且HERS細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)維持至少20代（圖f）。
產(chǎn)品清單
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